引言：干细胞治疗面临的挑战

近年来，间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）因其强大的组织修复能力和免疫调节特性，成为再生医学领域的明星细胞。据统计，自2015年以来，全球每年有超过100项临床试验，探索MSCs在心血管疾病、骨关节炎、糖尿病足溃疡等多种疾病中的应用。然而，一个关键瓶颈始终制约着MSCs的临床转化——如何高效、稳定地扩增足够数量的高质量细胞？

传统二维培养方式（如T175培养瓶）单次仅能产出400-1000万细胞，而临床治疗往往需要数亿甚至数十亿细胞。例如，一项针对缺血性脑卒中的临床试验表明，每位患者（按80kg体重计算）需要约8000万MSCs。按照传统二维方法，，不仅成本高昂，还面临操作繁琐、批次差异大以及细胞异质性等问题，很难满足未来大规模MSC需求。

在这一背景下，微载体三维培养技术应运而生，并迅速成为规模化生产MSCs的最优解。本文将深入解析微载体技术的最新突破、现存挑战及未来发展方向。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0167779924000015

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MSC扩增用微载体

微载体技术通过在动态悬浮环境中为细胞提供贴附和扩增的基质，实现贴壁细胞的大规模3D培养。

传统商业微载体通常是无孔的，一般由合成聚合物制成，如聚苯乙烯和聚乙烯醇。合成微载体易于获得、标准化且与GMP兼容，但由于初始细胞在微载体表面贴附率低以及收获时细胞脱落效果不佳，通常导致细胞产量低。为了促进细胞在这些生物惰性合成微载体上贴附，应用了表面涂层，包括动物源性（例如Cytodex 3™和SphereCol®）、重组蛋白（例如ProNectin®F）、人蛋白涂层（例如Cytodex 1™和Synthemax II®）或正表面电荷（例如Hillex®）。由于对制造可重复性和成本的担忧，由天然材料制成的商业微载体数量有限。例如，由天然明胶和纤维素材料制成的微载体是多孔的，允许更大的表面积用于细胞扩增；然而，批次可重复性和动物源材料是GMP合规临床转化需要重点关注的问题。

图1：华龛生物3D TableTrix® 微载体

相比之下，由明胶材料制成的可降解大孔微载体（例如3D TableTrix® 微载体），降解后显示出98%的细胞回收率，并维持了多向分化潜能。且即开即用，与其他商业微载体相比，所需准备时间更少。

开发可调节微载体

为了获得可定制的微载体用于MSC扩增，主要采用了两种策略：

(i). 通过表面修饰提高细胞贴附和收获效率：

对商业聚苯乙烯微载体进行表面涂层研究，以增强细胞贴附或脱落。例如，金属-有机框架涂层可以创建高度多孔的表面，从而实现更多的MSC增殖。热响应性聚合物涂层有助于细胞从聚苯乙烯微载体上脱落，而无需使用蛋白酶。然而，这些方法仍处于初步发展阶段，需要进一步优化。

(ii). 制造具有可调节特性的新型微载体：

用天然聚合物、合成聚合物、混合聚合物和液体乳液开发了一系列新型微载体。这些新型微载体的特性（如大小、孔隙度、机械刚度、形状和表面功能化）是可调节的，这为不同细胞类型和应用，提供了定制微载体的机会。但这些特性对MSC扩增的重要性尚未得到系统评估。研究显示由天然聚合物制成的微载体，如明胶和胶原蛋白，可以制造出比商业聚苯乙烯微载体更可重复的直径（直径分布减少超过10%），这将提高放大系统中的可重复性。

尽管能够调节微载体的弹性和刚度，但这些参数对细胞扩增和下游应用的影响尚未在微载体设置中得到表征，并且很少有研究将新型微载体与商业微载体标准进行比较。目前，该领域依赖于从传统平面系统中推断知识，因而可能无法准确转化为微载体系统。

优化微载体设计标准

由于在微载体制造中，没有明确的解决方案，甚至对提高产量的特性也缺乏清晰认知，因此迫切需要为微载体建立细化的设计标准（总结在图2A中）。

微载体设计思路：

1. 对于临床应用，微载体必须使用可重复的良好生产规范（GMP）级材料制造，这将防止免疫排斥和感染，避免出现批次间的差异。

2. 为了获得具有不同下游应用所需再生功能的间充质基质细胞（MSC），理想情况下需要制造能够定制其物理力学性能的微载体。

3. 为了扩大临床应用所需的MSC数量，需要从高效的微载体中收获细胞（即从微载体上收获所有高活率的细胞），以确保可重复和高效的细胞扩增。

4. 微载体需要与大规模制造和自动化培养平台（如生物反应器）兼容，以提高劳动效率。

总的来说，在满足这些关键标准的同时，至关重要的是在这些系统上严格验证MSCs，以证明其免疫调节特性的维持及其在特定应用中的干性和再生能力。

图2：新型微载体设计和临床应用细胞规模化生产考量

（引用自原文）

放大生产以实现转化应用

与平面培养相比，基于微载体的MSC扩增在空间效率上更具优势，并且通常显示出更高的细胞产量。然而，为了实现有效的临床转化，微载体制造和培养必须符合GMP标准，并与大规模制造系统兼容，以减少培养批次间的变异性，提高安全性，并增加细胞产量，同时最大限度的减少人工操作。

培养基和补料方案

为了临床应用，培养基必须是无异源的，以降低感染风险和宿主免疫反应（图2C）。血清替代品可以在内部分离或商业购买，并已成功用于微载体系统中MSC的扩增。与人血清替代品相比，化学成分明确的无异源培养基配方可能更具重现性，前者存在供应有限、成分不明确和批次间差异性大的问题。

图3：3D FloTrix® 间充质干细胞无血清培养基（左）

3D FloTrix® MSC化学成分限定无血清基础培养基（右）

与连续灌注相比，分批补料方案在大规模系统中更有利于促进MSC的有效扩增，同时保持细胞表面标记（图2C），且更具经济性，因为它们提高了培养基效率，降低了劳动强度，并且由于培养基消耗量更少而最具成本效益。溶氧水平也将影响批次间的可重复性，因此需要采用封闭系统，避免暴露于大气氧水平，从而防止改变细胞扩增速率。

动态培养系统

在过去几年中，对用于微载体培养的自动化、封闭式、工业规模的GMP级细胞生产平台研究较少，并且这些平台都使用了商业微载体（例如华龛生物3D细胞智造平台）。与静态条件相比，微载体-MSC复合物的动态培养可以上调涉及分化潜能、细胞代谢、细胞外基质动态、免疫调节功能和伤口愈合的细胞通路。

图4：华龛生物3D细胞智造平台

在动态培养系统中，封闭式生物反应器系统提供了比搅拌瓶培养更好的pH和溶氧浓度控制，并且可以将细胞产量提高500%以上。优化生物反应器设计，对于在低剪切力下悬浮微载体以最大化细胞活率至关重要，搅拌罐生物反应器设计最常用于可扩展和动态的MSC扩增。

控制流体力学极大影响着动态生物反应器环境中对微载体-MSC复合物的培养，其中需要优化搅拌速率、剪切力和微载体密度，以防止微载体碰撞，最大化细胞活率，并提供具有重现性的细胞产量。尽管间歇搅拌和连续搅拌方式都已进行了研究，其中间歇搅拌被认为有利于细胞贴附和生长，但大多数微载体系统采用连续搅拌，这取决于保持不同类型微载体悬浮的最低速率。总体而言，动态培养平台和流体动力学已得到严格优化，随着进一步扩展到更自动化和更大规模（500L）的生物反应器，这些系统将成为未来MSC扩增的重要临床工具。

3D培养监测工具

3D细胞培养实践的主要限制之一是监测细胞生长曲线、形态和汇合度，这促使人们进行非侵入性、非破坏性和自动化监测系统的开发。例如，在线介电光谱法可用于监测生物反应器培养中微球上的细胞生长。

以华龛生物3D细胞培养设备中搭载的PECALS® 控制系统为例，通过该系统可实时监测及自动调节转速、温度、酸碱度和溶氧，并进行在线活细胞计数，还可实现远程操作。

图5：华龛生物PECALS® 控制系统

结论和未来展望

微载体作为临床规模扩增MSC的重要工具，过去十年间在动态培养技术领域取得了显著进展。尽管商业聚苯乙烯微载体因易于获得、标准化而被广泛应用，但其在定制化和细胞功能维持方面存在局限性。因此，新型微载体应运而生，这些微载体可以改善例如细胞贴附、生长和脱落等影响细胞产量和功能的关键参数。此外，它们可调节的物理机械性能，以及易于功能化的特性，能够满足不同细胞类型和应用的需求。因此，未来的研究需在动态培养环境中对新型微载体进行全面评估，包括细胞的表型和功能特性。

此外，需深入研究新型微载体的孔隙度、弹性、表面功能化和刚度等特性对MSC功能的影响，以更好地满足特定临床应用的需求。随着小规模生物反应器的商业可用性增加，动态培养应成为微载体开发管道的一个基本组成部分。

在应用方面，同种异体MSC更适合现货型产品，而自体MSC则需要个性化的培养和验证。为了实现大规模细胞治疗，需要开发单批次至少能够生产数亿个细胞的扩增平台，同时解决原代MSC在传代培养期间功能逐渐丧失的问题。此外，还需建立包括高通量聚合物和微载体制造平台、细胞验证和监测工具、生物反应器以及储存细胞生物库在内的基础设施。未来的发展需要整合扩增流程的所有步骤，从微载体选择到大规模动态培养，以推动MSC扩增技术的全面进步。

3D TableTrix® 微载体

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① 更仿生：由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率>90%，粒径大小可控于50-500μm区间， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培养。

② 资质全：该产品已获得2项CDE药用辅料资质，登记号为【F20200000496；F20210000003】，3项FDA原料药及药用辅料资质，登记号为【DMF：037798、035481；MF：29721】

③ 易收获：特异性降解技术裂解微载体，收获相较于传统方式更高效更温和。

④ 更安全：拥有权威机构出具的裂解残留检测、细胞毒性、热原反应、遗传毒性、体内免疫毒理学相关质量评价报告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主动全身过敏性、腹腔注射给药毒性等安全性评价报告。

⑤ 易放大：通过3D培养方式，结合华龛生物3D细胞智造平台全线产品可以实现全自动封闭式大规模细胞培养，实现千亿量级细胞收获。

⑥ 更优质：通过3D多孔可降解微载体+ 动态培养技术，进行三维培养，优势显著——培养细胞体积更小、迁徙能力更强，同时具备更卓越的免疫调节和组织修复潜能。