在过去十年间，MSC-EV研究的规模与深度均呈指数级增长。源自脐带、脂肪组织、骨髓等不同来源的MSC所分泌的EV，携带大量具有生物活性的蛋白质、脂质及小RNA，可介导抗炎、促血管生成、免疫抑制及组织修复等多重效应（Riazifar et al., 2017; Jiao et al., 2024）。根据ClinicalTrials.gov数据，截至2025年，全球已有超160项EV相关临床研究登记注册，其中MSC来源EV占所有治疗性EV研究的最大比例（Na et al., 2026）。

但随着外泌体研究逐步从基础科研走向临床转化，一个更现实的问题开始浮现：外泌体质量与细胞质量有着强依赖关系，并不是“细胞培养上清简单浓缩一下”就能成为药物产品。

从实验室规模走向临床及商业化，EV生产工艺面临若干结构性挑战：

• 国际胞外囊泡学会（ISEV）于2023年更新的MISEV2023指南明确指出，制造工艺的标准化与可重复性是EV治疗产品开发的关键前提（Théry et al., 2018; Welsh et al., 2024）。

• 《细胞组分及衍生物治疗新技术临床研究备案指引》（中国国家药品监督管理局，2024年）亦对EV生产工艺的批次一致性、质量控制及规模化可行性提出了明确要求。

真正面向临床和产业化开发时，外泌体生产必须回答几个关键问题：

1、如何获得足够规模的高质量MSC细胞？

2、如何在不引入外源EV干扰的条件下，稳定收获条件培养基？

3、如何让整个工艺具备可放大、可监控、可追溯、可验证的GMP生产基础？

目前，MSC-EV生产中常见的上游工艺主要包括二维平面培养、中空纤维系统、固定床系统，以及微载体悬浮培养系统。不同路线各有适用场景，但从产业化角度看，其核心差异主要体现在规模化能力、过程可控性、取样便利性、工艺透明度和批次一致性上。

中空纤维系统虽可实现一定程度的规模化，但其工艺透明度低、清洁验证困难，且批次间取样与过程分析受到显著限制（Rohde et al., 2019）。固定床生物反应器对剪切敏感性MSC的放大验证数据目前仍相对有限。以搅拌式生物反应器与微载体相结合的3D培养方案，因其工艺参数可监控、可控制、可放大的优势，正逐渐成为GMP级MSC及EV生产的主流技术路线（Lim et al., 2018; Cunha et al., 2021）。

2D平面培养

——适合早期验证，但不适合规模化生产

2D培养是目前最常见的实验室方案，包括培养瓶、多层细胞工厂、CellSTACK等形式。

优势：操作简单、研发门槛低、工艺经验丰富，适合早期机制研究和小规模样品制备。

劣势：其面积扩展性受限严重，在保持细胞形态与功能完整性的前提下，单批次所能达到的细胞数量难以满足每批次数十乃至数百升收获上清的商业化需求。当外泌体生产从毫升级、升级到升甚至百升级条件培养基时，2D培养的瓶颈会迅速暴露：培养面积扩展困难、人工操作多、耗材占用大、批间一致性差、开放操作风险高。

中空纤维系统

——高密度连续收获，但工艺透明度不足

中空纤维系统可以让细胞在较小空间内实现高密度生长，并通过灌流方式持续收获条件培养基。

优势：封闭程度较高、上清浓度较高、可实现连续收获，适合探索持续分泌型EV生产模式。

劣势：中空纤维系统虽可实现一定程度的规模化，但其工艺透明度低、清洁验证困难，且批次间取样与过程分析受到显著限制（Rohde et al., 2019）。该系统的核心问题在于“看不清”，细胞在系统内部的分布、生长状态和代谢状态不易直接观察，取样和过程分析受到限制。对于药物开发而言，工艺透明度不足会增加放大验证、批间一致性评价和质量研究难度。

固定床系统

——培养面积提高，放大均一性仍需验证

固定床或片状载体系统通过结构化载体提升单位体积培养面积，可在相对封闭的体系内进行MSC培养和上清收获。

优势：相比2D培养，它在自动化、封闭化和培养密度方面有所提升。

劣势：对剪切敏感性MSC的放大验证数据目前仍相对有限。固定床内部容易形成营养、氧气和代谢物梯度。随着规模扩大，床层内细胞分布是否均一、不同位置细胞状态是否一致、上清收获是否稳定，都需要充分验证。

因此，这一路线适合部分灌流式生产场景，但在MSC-EV药物开发中仍需重点关注床层均一性和放大后的质量可比性。

微载体悬浮培养系统

——更适合MSC-EV产业化上游平台

将贴壁依赖性MSC附着在微载体表面或多孔结构内部，在搅拌式生物反应器中实现三维悬浮培养。相较于2D培养，以搅拌式生物反应器与微载体相结合的3D培养方案，因其工艺参数可监控、可控制、可放大的优势，正逐渐成为GMP级MSC及EV生产的主流技术路线（Lim et al., 2018; Cunha et al., 2021）。

这一体系兼具三个关键优势：

• 第一，培养面积不再依赖平面耗材堆叠，单位体积细胞产量更高；

• 第二，转速、pH、溶氧、温度、换液节奏等关键参数可以监控和记录；

• 第三，取样更方便，便于实时评估细胞密度、活率、代谢状态和EV收获表现。

当然，微载体悬浮培养也不是简单替换2D培养。它需要系统优化微载体类型、接种密度、贴附效率、搅拌剪切力、换液策略和收获窗口。但正因为这些参数可以被开发、被记录、被验证，微载体悬浮培养更适合作为MSC-EV临床转化和商业化生产的上游平台。

小结

四大工艺路线的核心判断 👇

从产业化角度看，MSC-EV上游工艺的竞争已经不是“哪种方法能收获EV”，而是“哪种方法能稳定、可控、可放大地获得高质量条件培养基”。

2D培养解决了早期研发问题，但难以解决规模化问题；中空纤维和固定床系统提升了培养密度，但仍需面对过程透明度和放大验证挑战；微载体悬浮培养则在细胞扩增效率、过程监控、取样分析和GMP适配之间取得了更好的平衡。这也是华龛生物选择以“多孔微载体 + 搅拌式生物反应器”构建MSC-EV上游工艺平台的核心原因。

Part.1

3D FloTrix® 工艺平台概述

3D FloTrix® 平台由华龛生物自主研发，是一套面向MSC及相关细胞产品规模化制备的整合式工艺基础设施，核心产品线覆盖从种子制备、3D扩增、上清收获到EV下游处理及成品灌装的全流程节点。

以3D RecomTrix® 重组胶原微载体、3D FloTrix® MSC成分限定培养基、3D FloTrix® vivaSPIN-SU一次性生物反应器、3D FloTrix® megaEXO外泌体收获系统以及3D FloTrix® vivaVIAL西林瓶灌装系统，可构建非动物源、一次性的外泌体制造工艺；其中EV收获阶段采用化学成分限定培养基，并通过培养基切换、过程控制和背景检测，降低外源颗粒/EV对产品表征与质量评价的干扰。

这套覆盖细胞扩增、上清收获到纯化灌装的3D FloTrix® 外泌体一站式规模化制备整体解决方案已在CPIC 2026大会上正式发布（<<点击查看详情），吸引了现场不少业内同行的密切关注。结合该方案的真实实验数据，本篇文章将聚焦外泌体生产链条中的上游环节——MSC细胞规模化培养与条件培养基收获工艺，探讨如何通过标准化的3D培养平台，为外泌体生产建立稳定、可放大、可复制的上游提供可能性。

实验结果表明，3D FloTrix® 平台在EV产量、粒子浓度、关键质量属性（CQA）及规模化可行性方面均表现出优势，有望成为MSC-EV商业化生产的核心工艺基础设施。

Part.2

3D FloTrix® 工艺平台案例

01、细胞来源与种子制备

本研究所用MSC来源于人脐带华通胶（UC-MSC），供体经充分筛查，符合《细胞组分及衍生物治疗新技术临床研究备案指引》对于起始物料的相关要求（国家药品监督管理局，2024年）。细胞采用种子细胞库的P4代细胞；全程检测结果显示细胞表型符合ISEV推荐的MSC最低鉴定标准（MSC positive：CD73/CD90/CD105 ≥95%；lineage negative：CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR ≤2%）（Théry et al., 2018; Welsh et al., 2024）。

02、工作细胞扩增

P4种子至P5工作细胞扩增阶段采用含人血小板裂解物（Human Platelet Lysate, hPL）的3D FloTrix® 间充质干细胞无血清培养基（RMZ112）。该阶段主要用于工作细胞扩增，hPL作为人源培养添加物用于支持MSC快速增殖；在后续EV收获阶段，工艺切换至化学成分限定培养基，以降低外源EV背景对条件培养基收获和EV质量评价的影响。细胞与3D RcomTrix® 重组胶原微载体（CW01）接种至3D FloTrix® vivaSPIN-SU一次性生物反应器。

在SU生物反应器中，UC-MSC自接种至收获阶段持续培养4天，扩增倍数达到14倍。扩增全程细胞活率维持在85%以上，收获活率98.04%，表型检测（CD73/CD90/CD105）阳性率≥95%，符合MSC鉴定标准。

▲图1 （左：细胞扩增曲线；右：细胞活率变化曲线）

03、灌流持续收获

P5代工作细胞至P6代产物收获阶段采用完全化学成分限定的3D FloTrix® 间充质干细胞化学成分限定培养基（RCD288），细胞高密度接种至3D FloTrix® vivaSPIN-SU一次性生物反应器进行灌流培养，培养体积为3L，Day2~Day6进行每48h收获1L，Day6后每24h收获1L，共收获13L。同时进行T75二维对照培养，培养体系为12ml，每72h进行全换液收获。

对2D连续培养（T75，每3天换液12mL，以下简称“2D连续方案”）与3D重组胶原微载体+成分限定培养基+反应器灌流培养方案（Day2–Day6每48h灌流1 L，Day6后每24h灌流1 L，以下简称“3D微载体灌流方案”）的EVs产出进行了比较，重点考察上清NTA浓度与单位培养基颗粒产量。

04、实验结果及外泌体评价

▲图2 颗粒浓度变化曲线（2D vs 3D）

▲图3 3D微载体灌流方案的细胞活率变化曲线

▲图4 3D微载体灌流方案糖含量变化曲线

2D连续方案与3D微载体灌流方案EV产出对比数据

3D微载体灌流培养Day16收获终点-MSC表型鉴定

结果显示，若按单位培养基外泌体颗粒产量推算，3D微载体灌流方案约为2D连续方案的3倍；若仅比较上清NTA浓度，3D微载体灌流方案后期稳定在1×1010 particles/mL左右，而2D连续方案最高约为3.6–3.9×109 particles/mL，表明3D微载体灌流方案在单位培养基效率、连续收获能力及工艺放大潜力方面均具有明显优势。细胞活率保持较高水平且表型正常，葡萄糖消耗趋于稳定，这表明灌流策略更有效地利用培养基并保持了良好细胞状态。

在本次研究中，我们首先通过纳米颗粒跟踪分析对样品进行粒径和颗粒分布评价。结果显示，样品颗粒主要集中在约30-200nm之间。透射电子显微镜观察进一步显示，样品中可见具有完整边界的圆形或杯状膜性囊泡，尺寸与NTA检测结果基本一致，为EV形态学表征提供了直接证据。

▲图5 样品颗粒粒径变化曲线

▲图6 样品颗粒电镜图

在完成基础表征后，我们进一步采用细胞促增殖以及划痕实验评价3D微载体灌流培养所得外泌体样品的体外功能活性。

细胞促增殖实验结果显示，与空白对照相比，3D微载体灌流培养所得外泌体的两组剂量均能够提高细胞增殖水平，其中高剂量组整体表现更强，提示样品具有促进细胞增殖的潜力。

在细胞划痕实验中，给药24小时后，两组剂量的划痕区域均出现更明显的闭合。定量结果显示，剂量1和剂量2均显著提高细胞迁移率，并且剂量2高于剂量1，呈现一定的剂量依赖趋势。

▲图7 细胞划痕实验结果

综合粒径、形态、蛋白和功能实验结果，本次研究初步进行了EV基础表征和体外功能评价：

样品具有符合预期的纳米颗粒分布和膜性囊泡形态，并在体外表现出促进细胞增殖和迁移的生物学活性。需要强调的是，体外增殖和迁移实验反映的是产品功能潜力，不能直接等同于临床疗效。后续仍需要结合具体适应症，建立更加明确的作用机制、效价方法和批间一致性评价体系。

05、全流程产量推算模型

基于上述实验数据及规模化验证结果，下表提供了以不同工艺规模的一次性生物反应器为核心的全流程EV理论产量推算参考，供工艺团队进行产能规划与经济效益评估。

基于3D FloTrix® vivaSPIN/megaSPIN不同规格的EV全流程产量推算模型

注：理论产量按每毫升上清约10¹⁰颗粒（浓缩纯化前）、回收率≥70%的保守估计计算。

由产量推算模型可见，通过3D FloTrix® megaSPIN 并联配合3D FloTrix® megaEXO外囊泡处理系统，EV总量达10¹⁵颗粒量级，理论上可支撑2000剂/（5×10¹¹/剂，依据具体适应症每剂量颗粒数需求而定）的批次生产，充分满足II/III期临床研究及初期商业化的供应需求（Gupta et al., 2021）。

外泌体产业正在进入一个新的发展阶段。过去，行业更多关注“能否获得EV”、“EV是否具有功能”；而现在，随着MSC-EV逐步走向临床转化和产业化开发，真正决定产品能否走远的关键，已经转向“能否稳定生产”、“能否规模放大”“能否建立清晰的质量标准”。

对于MSC-EV生产而言，本文展现的灌流持续收获是一条极具产业化价值的工艺路径。通过在同一批高质量MSC细胞基础上进行持续灌流进行上清收集，可以提升单批细胞的利用效率以及单位体积培养基产率，增加EV总产出，并降低前端细胞扩增所带来的时间、空间和物料成本。这不仅是生产效率的提升，更代表着外泌体制造逻辑正在从实验室制备走向工程化生产。

但华龛生物认为，真正成熟的多次收获工艺，不能只追求“收获次数更多”或“颗粒总量更高”。面向临床转化和商业化生产，工艺开发还需要回答一个核心问题：在规模化产出的前提下，保证质量和功能一致性。

因此，后续仍需围绕多次收获的可行性开展系统验证：

• 首先，应持续评估不同收获轮次中MSC细胞活率、代谢状态以及CD63、CD9、CD81等EV相关标志物表达的批次稳定性，确保EV生产源头处于稳定、可控的状态。

• 其次，需要关注随收获次数增加，EV关键组分是否发生显著漂移，包括粒径分布、颗粒浓度、膜蛋白标志物、蛋白组成、核酸组成及杂质谱等关键质量属性。

• 最后，收获次数过多可能导致细胞营养压力增加、代谢负担加重或应激状态改变，进而影响EV的生物学功能。

因此，不同收获轮次的EV还需结合免疫调节、抗炎、促血管生成、组织修复等有效性实验进行横向比较，明确合理的收获窗口。

这也意味着，MSC-EV上游工艺开发不能停留在经验驱动阶段，而应进入以数据为基础、以质量为导向、以放大验证为核心的新阶段。工艺平台需要同时回答产量、质量、功能和可制造性四个问题，才能真正支撑外泌体产品从科研样品走向临床级、产业级生物制品。

作为细胞产业化技术平台企业，华龛生物始终坚持以工程化思维推动细胞及细胞衍生物产品的规模化制备。围绕MSC-EV生产，华龛生物将持续完善以3D FloTrix® 多孔微载体、vivaSPIN搅拌式生物反应器、成分限定（CD）无外源EV培养基收获策略及下游工艺衔接为核心的整体解决方案，推动外泌体生产从“手工化、小批量、经验型”走向“标准化、规模化、可验证”。

未来，华龛生物将继续以底层工艺平台创新为支点，服务更多细胞治疗、再生医学和外泌体药物开发团队，共同建立更高质量、更高效率、更具可及性的细胞产业化生产体系。我们相信，细胞产业化的新时代，不仅需要新的产品，更需要新的制造基础设施。华龛生物愿与行业伙伴共同推动这一进程，让细胞技术真正从实验室走向临床、走向产业、走向更广泛的患者获益。

参考资料：

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• Gupta, D., Zickler, A. M., & El Andaloussi, S. (2021). Dosing extracellular vesicles. Advanced Drug Delivery Reviews, 178, 113961.

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